韩春雨：我的基因编辑系统还只是“手动档” |科学人
三年前，CRISPR/Cas9基因编辑系统在生物学界掀起了一阵风暴。这把简单易用的“基因剪刀”很快成了生物学家的宠儿。这三年间，在生物学的“裁缝铺”里小到细菌和寄生虫，大到小鼠甚至人类胚胎，随处可见用CRISPR/Cas9对基因组修修补补的科学家们——另一批科学家则致力于将这把“剪刀”打磨得更加好用。
而今年5月，“裁缝“们突然得到了一个好消息：来自河北科技大学的青年科学家韩春雨，发明了另一种能用于基因编辑的“剪刀”。
韩春雨发表在《自然·生物技术》杂志上的论文讲述了一类名为Argonaute的蛋白质在基因编辑中的作用。与CRISPR/Cas9系统类似，基于Argonaute诞生的基因编辑系统也得益于这一蛋白自身的核酸内切酶活性——它们的核心都是“剪刀”。只不过，在韩春雨建立的系统里，引导这把“剪刀”的手，从RNA变成了DNA。
这一小小的改变将在分子生物学界掀起怎样的波澜？5月16日，韩春雨回到自己接受博士训练的北京协和医学院做学术报告，讲述了他在这一发现背后的故事。
在CRISPR/Cas9横空出世之前，基因组编辑主要依靠锌指核酸酶（ZFN）或类转录活化因子核酸酶（TALEN）这类以蛋白质为导向的基因编辑技术。韩春雨回忆说，在那时他也想用基因编辑做些工作，但当时的技术又费钱又不方便，“像锌指和TALEN这些方法我用不起。”他说，CRISPR/Cas9技术的问世实现了一个质的飞跃，CRISPR的文章刚发出来没几天，他就迅速关注并做了跟进工作。
然而，他小小的实验室在做CRISPR相关的工作时屡屡落后于国外的一些研究团队，最终他决定把这方面的工作停下来了。“得做些更原创性的才能超过那些实验室。”韩春雨想。后来，他一方面继续在Cas家族里找其他可能的基因编辑工具，另一方面则密切关注另一种可能——和CRISPR/Cas系统类似，Argonaute（AGO）也是微生物防御系统中的一种重要蛋白。这会不会是新基因编辑工具的诞生地？
后来，一些研究者发现细菌嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）和古菌激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的Argonaute蛋白能在与一段5’端磷酸化的单链DNA结合之后，被引导到与该段DNA相匹配的基因组片段上做定向切割。
看名字不难想象，这两种微生物能够在很高的温度下存活，激烈火球菌的最适生长温度更是夸张的100℃。因此，它们的Argonaute需要在高于65℃的条件下才能发生上述反应。可要知道，常见的人和鼠细胞系需要在37℃的条件下存活和生长，在这种情况下，低于65度就会“熄火”的Argonaute显然派不上什么用场。
一把好“剪刀”近在眼前却用不了？韩春雨决定绕开这个障碍：在相对低温环境生活的菌里，类似的Argonaut可能就有适用的活性。在这样的背景下，韩春雨课题组的第一个目标就是找到能够在37℃时具有活性的Argonaute。他将高温环境下生活的菌全都筛走，再检查剩下的候选。“咱实验室没那个条件去合成，都是到各个菌株库里面去买，甚至还想到根据它的生境去从土壤里分离。当时我还在药店买过螺旋藻，不过后来用不上，就都吃了。”韩春雨笑着回忆。
最终，他们在一种被称为格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的古菌中找到了具有同样功能的Argonaute蛋白——NgAgo，而它在37℃时具有活性。在获得纯化的蛋白后，韩春雨课题组首先尝试在体外对目标基因进行切割。他们发现，仅在提供与目标片段相匹配且5’端磷酸化的单链DNA后，NgAgo能够对目标片段进行双链切割。
这种能充当基因“剪刀”的蛋白来自格氏嗜盐碱杆菌。图片来源：africa.gbrcn.org
“而我后来知道，许多的研究组在致力于将高温菌中Argonaute的活性温度降下来。那我在这一步就快多了。”韩春雨在报告会上说，“在动手之前，一定先仔细琢磨，先想清楚。这是我认为特别重要的。”
随后的研究中，韩春雨发现了NgAgo具备的更多特性：它不但以长度为24nt、5’端磷酸化的单链DNA作为寻找切割目标的引导，而且一旦和一条引导DNA结合之后，“专一”的NgAgo就不会在37℃条件下就不会将它“抛弃”。而且，NgAgo这把“剪刀”下刀极为小心——如果所在的基因组序列有三个地方跟引导DNA对不上，它基本上就不会下手切割。韩春雨推测，NgAgo一旦和引导DNA结合之后就会发生构象改变，变成一个崭新的序列识别蛋白。最后，他们发现，NgAgo有“顺手牵羊”的习惯：在目标区域完成切割后，它总会直接顺手“带走”目标区域的一部分（1-20bp）。对这些特性的后续研究，将成为完善这一工具提供参考。
在论文的最后一部分，韩春雨课题组利用NgAgo系统在细胞内进行了“实战演习”——尝试对人细胞DYRK1A基因进行编辑。他们将得到的结果与CRISPR/Cas9系统相比，最终发现，两者的基因编辑效率相当。一款有效的新基因编辑工具，由此问世。
论文发表后，韩春雨的结果随即在国内引起广泛关注，一些报道甚至将NgAgo称为会取代CRISPR/Cas9的基因编辑技术。不过，韩春雨强调：“我们的实验是比较初步的。NgAgo和Cas9之间的比较，还有待世界上其他的实验室来进行更多的验证。”
理论上，与Cas9相比，基于NgAgo的基因编辑技术具有独特的优势：相比于需要特定结构的引导RNA进行切割的Cas9系统，以单链DNA模板完成基因编辑的NgAgo系统在实验设计上更为灵活，受到的限制更少。而且，NgAgo需要的引导模板更长（24个碱基，Cas9系统的引导模板需要20个碱基），利用它进行基因编辑的精确性也相对更高。
但是，NgAgo系统也有其不足和尚待优化之处。“要知道单链DNA是不是可以用来引导核酸酶，你需要知道细胞中的单链DNA本底是不是高——要是细胞里充满了短链的单链DNA那怎么办？”韩春雨说。所幸，在人体细胞中，这样游离的单链DNA特别少，但在别的细胞中，NgAgo会不会受到其他单链DNA的干扰而“迷路”还尚待验证。除此之外，NgAgo“顺手牵羊”的特性使得它可能无法像Cas9一样具有精确到碱基的编辑和修复能力。作为引导的单链DNA要如何更高效地导入，也是目前NgAgo技术的一个瓶颈。
最后，作为NgAgo优点之一的“专一性”（one guide faithful），在大规模基因编辑中可能成为它的短板——在同时进行多靶点编辑这件事上，NgAgo可能牺牲了一点灵活性。不过，韩春雨表示，NgAgo系统“对多个点进行敲除是完全没问题的。”
“CRISPR/Cas9经过优化之后已经是个成熟的系统，就好像是一辆自动档汽车；NgAgo系统现在还是初版，是一个手动版本。”韩春雨在会上幽默地打着比方，“我们实验室正在致力于把它也改进成自动档。”就目前来看，对于被“自动档”的Cas9系统主导的生物学界来说，NgAgo可能是一个很好的补充。
韩春雨也指出，他的文章“最大的亮点其实是告诉大家，Ago家族有很多可能能做基因编辑的（蛋白质）。好比说原来有一个菜市场卖菜，有十几个菜摊儿；现在我告诉大家，那边还有一个大菜市场呢。”
开发CRISPR/Cas9系统的先驱、麻省理工学院的张锋与韩春雨的观点可谓不谋而合。“看到世界上有那么多研究者通过开发新技术和新方法来继续扩充基因编辑的‘工具箱’，是一件很美好的事情。”张锋对科学人说，“这些努力将切实地改善人类健康的未来。对科学来说这是个令人兴奋的时代。”
尽管新论文引起广泛关注，韩春雨依然心系着自己的实验。在发言中，韩春雨也多次与前来听报告的学生分享心得和实验的要点：“做实验一定要注意观察，不要小看实验细节。”“有责任心，善始善终。”“你一定要看着自己做的实验，观察它每一次的不同，琢磨其中的原因。因为这个是你的责任。”“策略很重要。”“要用最简单有效的方式一步到位地说明问题。”……他也鼓励在座的学生：“不要怕MIT的。”——这句话从研究组只有三个人的韩春雨口中打趣说出，一下子让学生们笑着鼓起了掌。
但韩春雨也不止一次强调，他们急迫地需要把目前还是“手动档”的NgAgo系统优化成“自动档”。而只靠三个人能完成的工作，毫无疑问是极为有限的。“我昨天刚做完一板转染过来的。”刚到会场的韩春雨说。在采访、报告和各类合作的关注下，他最近忙得不可开交。但“我还是喜欢做实验。”韩春雨说，“我还要重新隐匿到我的实验室当中。”
NgAgo的成果无疑值得欣喜，但同时，新技术的成熟需要时间。人们也应该看到这新生的“手动档”存在的不足。假以时日，我们也许能看到“中国制造”的生命科学技术在世界各地的实验室中开花结果。但至少目前，不管是做相关研究的人还是围观的人，还是要像韩春雨自己所想的那样，踏实下来，步步为营。希望又一引领生命科学向前飞驰的“自动档”，能更早、更稳当地出现在我们面前。
（编辑、排版：Calo）
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